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流式抗體的選擇:
1、流式抗體本身也是抗體,所以選擇流式抗體一定要滿足抗體選擇基本的條件:目標蛋白特異性,反應種屬以及應用實驗。
2、流式抗體熒光標記的方式包括直接標記和間接標記兩種。在流式實驗過程中,盡量減少實驗工序和過程,以保證實驗的真實和準確性。因此在條件允許的范圍內,建議盡量用直接標記的抗體進行實驗而不去做間接標記。
3、流式抗體熒光標記的選擇:如果實驗中檢測單一指標:不同熒光標記在不同的儀器上強度不同。FACS Calibur儀器為例:PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5,通常來說,PE*,適用于弱表達抗原。FITC強度較弱,適用于強表達抗原,使用范圍比較廣。用戶需根據檢測的目標蛋白進行具體選擇。如果同時檢測多個指標:確認流式細胞儀能檢測多少個通道:流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。各個通道之間的熒光素可以隨意搭配。如:實驗者同時檢測三個指標,可以在圖1中綠色、和紅色三個通道中各選一個適當的熒光素標記,FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指標選擇同一個通道的熒光標記,以防止熒光的重疊和相互干擾,影響后結果。因此,流式細胞儀的通道越多,同一份樣本能同時做的表面/胞內標志就越多。常用熒光標記包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。
同型對照的選擇:流式抗體的選擇使用注意事項:
1、建議實驗細胞的數量和抗體的比例要適當。細胞過量或抗體過量都可能使實驗結果受影響,因此需要優化試驗條件。注:不同的流式技術對抗體的需求量有較大差異,例如傳統流式細胞術(采用鞘液流系統)需要1×106個細胞為起始上樣量,抗體用量為10μl,而微流式細胞術則只需5×105個細胞,抗體用量減少到5μl。
2、 直標的流式抗體應該4℃避光保存,不要冷凍。